Presentación de la Dra. Annika Vogt – 9 ° Congreso Mundial de Investigación Capilar 2015 – Miami, FL
Un análisis de las diferencias químicas, estructurales y funcionales entre el cuero cabelludo que ya ha sufrido la caída del cabello y el cuero cabelludo no afectado. También se cubrió el establecimiento de nuevos procesos para realizar este tipo de investigaciones.
La necesidad de comprender las causas del “proceso de la enfermedad” en la caída del cabello es de primordial importancia. Los métodos actuales para examinar varios aspectos del funcionamiento del folículo piloso y cómo se ve afectado por la alopecia androgenética y otras alopecias son ineficaces. Del mismo modo, es difícil poder probar si un tratamiento funciona de manera eficiente debido a la necesidad de múltiples facetas del proceso de prueba, que incluyen recuentos de cabello, biopsias y otros pasos manuales inconvenientes.
Se discutieron métodos para examinar la efectividad de los tratamientos tópicos para la caída del cabello, incluida la tomografía de coherencia óptica, métodos experimentales, lecturas y procesos moleculares. Se realizó una prueba inicial de 6 y luego 12 personas para ejecutar estos métodos de análisis sobre la efectividad de Minoxidil. El enfoque fue utilizar marcadores de ARN que esperaban encontrar consistentes en múltiples pacientes, que podrían ser monitoreados como un nuevo estándar en futuros ensayos clínicos. También se examinó la capacidad de recolectar muestras de cabello de pacientes de una manera no invasiva que podría usarse en ensayos futuros.
Orador: Cambiaremos un poco el orden que se presentó en la agenda, tendremos nuestro próximo orador y luego responderemos algunas preguntas. Luego tendremos a los oradores restantes que responderán algunas preguntas más. Entonces, si podemos tener la próxima presentación. Nuestra próxima oradora es la Dra. Annika Vogt. Es médica senior en el Centro de Competencia Capilar y Unidad de Dermatología Pediátrica, así como Directora Científica de Investigación Experimental y Traslacional en el Departamento de Dermatología de la Charité-Universidad de Medicina en Alemania. También es profesora en París en la Universidad de Pierre et Marie Curie.
Dr. Vogt: Estamos muy contentos de ver que nuestra sesión atrajo a tantos participantes. Después de esta charla tan impresionante y emocionante, ahora estamos cambiando más hacia el enfoque clínico y tratando de comprender un poco el proceso de la enfermedad. Es complejo entender este órgano y ver cómo podemos llegar realmente a un nivel en el que no nos centramos en una sola faceta y somos realmente capaces de regenerar, en este caso, folículos pilosos o, en nuestro caso, comprender realmente la enfermedad y también la acción del fármaco.
Ahora hablaré un poco sobre los protocolos que desarrollamos en nuestro laboratorio para mejorar la forma en que realizamos nuestros ensayos clínicos y también acelerar nuestras lecturas. Debo decir que gran parte del trabajo que presento ahora es parte de un proyecto de investigación iniciado por una investigación, donde recibimos fondos de Johnson & Johnson.
Pero el punto de partida, quiero decir, aquellos que han estado siguiendo mi trabajo durante los últimos años, saben que lo que más me interesa es la administración de fármacos dirigida y el empaquetado de moléculas activas dirigidas a crear de otras formas dermatoterapia fotónica. Así que nos encontramos en una posición en la que sentimos que es realmente difícil tener evaluaciones rápidas de compuestos novedosos y también de formulaciones novedosas. Cuando se trata de estudiar los procesos moleculares e identificar nuevos objetivos, solo podemos mirar siempre a partir de preguntas muy específicas.
Lo que queremos ver es todo el proceso de la enfermedad en el folículo, pero realmente confiamos en las biopsias de los pacientes. Así que esto limita la forma o las cosas que podemos hacer con nuestros pacientes porque no somos libres de tomar biopsias en tantas cantidades como queramos, y no es tan cosméticamente aceptado. Como si tuviéramos alopecia cicatricial, por ejemplo. La gente no está muy contenta de tener cicatrices [inaudible] después de un ensayo clínico. Así que trabajamos mucho en cultivos de órganos. Con el cultivo celular, podemos probar ciertas vías de señalización y ciertas preguntas. Pero sería realmente bueno si pudiéramos agregar marcadores moleculares a nuestra comprensión actual de lo que vemos en los ensayos clínicos.
Porque la situación típica es que lo que tenemos, y aquí se centrará en la alopecia androgenética, es una situación típica para los ensayos de eficacia de un fármaco. Verá aquí a un paciente masculino. Lo que generalmente queremos ver es a los que participaron en nuestra sesión de Ulrike esta mañana, ahora podemos hacer pruebas de mini-zona. Tenemos ciertas áreas en las que queremos enfocarnos, pero luego todavía tenemos la situación de que tenemos que esperar muchas semanas para sentarnos allí y tener paneles de expertos globales y negociar números de folículos pilosos y micrómetros de grosor. Entonces sentimos que queríamos buscar diferentes formas de mejorar la forma en que hacemos estas pruebas.
Así que diseñamos una configuración en la que queríamos prepararnos para tener una prueba androgenética eficiente o una prueba de tratamientos tópicos para la alopecia androgenética. Sentimos que queríamos observar el frontal, vértice y occipucio usando los métodos clínicos: agregando a nuestro panel cosas como tomografía de coherencia óptica (lo mostraré en un minuto) y agregando métodos experimentales y lecturas que nos dirán un poco sobre el medio cuero cabelludo/piel, que es realmente difícil de imitar in vitro, y también los procesos moleculares. Ahora lo guiaré un poco a través de esos estudios complejos que creamos y probamos en seis personas, hasta que luego repetimos todo el procedimiento en 12 personas y monitoreamos la efectividad de los tratamientos con minoxidil, como Ulrike presentó esta mañana.
Así que estábamos tratando de generar material proteico que nos ayudara a observar el medio del cuero cabelludo, y decidimos mirar el material de ARN de los folículos pilosos arrancados. Porque si arrancas los folículos pilosos y hay [inaudible], y también tuvimos discusiones, por supuesto, no eliminas estos compartimentos enteros, pero sería muy bueno poder arrancar los folículos pilosos, obtener una lectura molecular, y luego, con el tiempo, volver a la misma área o, al mismo tiempo, mirar diferentes sitios para obtener una visión más completa de lo que está sucediendo con este paciente. Entonces, la idea era buscar si podemos generar datos robustos de microarrays de ARN que nos permitan configurar un panel de marcadores moleculares seleccionados que luego podríamos usar en múltiples ensayos futuros.
Entonces, lo que hicimos aquí fue, dijimos, si quieres, y no estábamos realmente seguros de cómo sería la variabilidad inter e intraindividual si realmente decidiéramos hacer microanálisis. Así que elegimos a seis personas y dijimos que tenían que tener AGA, Norwood-Hamilton IIIv-IV. Una población de estudio muy limitada y bien seleccionada.
Nuestro objetivo era probar los diferentes enfoques de las colecciones de muestras no invasivas, principalmente para integrarlos en un paquete agradable para un ensayo clínico, lo cual es factible en un paciente que es aceptable. Pero también usamos lo que encontramos para buscar un poco más marcadores moleculares.
Entonces, un desafío para comenzar fue integrar los diferentes métodos que estábamos usando en nuestro protocolo de estudio, lo que permitió el manejo en tres sitios de investigación, de una manera que no interfiera con los diferentes enfoques que queremos hacer. Así que teníamos las lecturas clínicas habituales: el fototricograma, en el que se afeita este círculo de 1,8 de diámetro. Luego integramos imágenes ópticas (tomografía óptica coherente) y también ultrasonido. Un nuevo método y/o la depilación junto a él, así como el método que presentaré, que nos permite recolectar proteínas de la superficie de la piel para llegar a mirar las diferentes porciones. También porque la depilación del cabello, por supuesto, solo produce un material limitado. Estábamos pensando que si terminamos con datos de matriz, podríamos querer tener algún material proteico, al menos, para validar o hacernos una idea.
Entonces, lo primero fue que obtuvimos los resultados clínicos regulares con el fototricograma de estos tres sitios afectados, que mostraré en la tabla de la siguiente diapositiva, y confirmaron que teníamos exactamente la etapa IIIv que estábamos buscando. Descubrimos que la ecografía de 20 MHz, que estábamos haciendo para ver si podíamos aprender algo desde los ángulos o la extensión del folículo piloso, no era muy reproducible. Encontramos estudios similares a los que habíamos hecho antes sobre el recrecimiento del cabello, que para muchos pacientes, las mediciones de venta libre de los tallos del cabello en crecimiento justo al nivel de la superficie de la piel podrían ser útiles. Aquí, tuvimos cambios muy significativos en el diámetro, por lo que podría ser una adición muy útil a las lecturas regulares del fototricograma Trichoscan.
Luego, debido a que con frecuencia hablamos de microinflamación o participación de composiciones de sebo de dermatitis seborreica subclínica, queríamos agregar las lecturas anteriores. Hemos visto en muchas otras charlas que la gente estaba considerando la interleucina-A, por ejemplo, como el indicador clásico. Pero usualmente usamos Sebutapes. No estoy seguro si los que han trabajado con esas cintas. Estas son cintas adhesivas y requieren un afeitado bastante extenso.
Entonces, lo que hicimos fue algo: las personas que siguieron nuestro trabajo saben que nos gusta jugar con resina a base de cianoacrilato. Básicamente, superpegamento, y tenemos mucha experiencia en otras partes del cuerpo porque lo usamos para la entrega dirigida de moléculas al folículo piloso para mejorar la penetración. Aquí utilizamos el método del superpegamento, que nos permite eliminar el 30% del estrato córneo. Es bien tolerado y solo ofrece una pequeña variedad, básicamente un intervalo, pero en realidad no destruye la integridad de la piel.
Usamos esta característica muy especial del cianoacrilato para fluir específicamente hacia los folículos pilosos. En el uso anterior, lo habíamos usado en un enfoque farmacológico muy específico [inaudible] para obtener yesos de las aberturas de los folículos pilosos. Y junto con todos nuestros socios, pudimos recolectar medicamentos materiales que habíamos aplicado tópicamente desde la abertura del folículo piloso.
Lo que hicimos en este estudio, combinamos estos enfoques. Este fue el estudio donde recuperamos material. Pero ahora, en este nuevo estudio, lo hicimos en el área circular afeitada que habíamos usado personalmente para los fototricogramas, así que lo afeitamos hasta el nivel de la superficie de la piel e hicimos una de estas eliminaciones en un área de 1,5 cm de diámetro. Y hacer esto nos permitió eliminar las capas del estrato córneo superior, pero más representativas que solo el material de la superficie de la piel, oops, lo siento, más los cilindros foliculares. Así que sentimos que obtendríamos una lectura bonita, más específica del folículo, de lo que encontramos aquí en la apertura de las partes del infundíbulo.
Hicimos muchas pruebas de cuantificación de proteínas porque normalmente tenemos ensayos colorimétricos que interfieren con los componentes del pegamento. Pero aquí pudimos aludir a las proteínas para su análisis y normalizarlas al contenido total de proteínas.
Les había mostrado la cuantificación de la interleucina-1α y el antagonista del receptor, que es estándar, pero luego pensamos que también podría ser adecuado para aprender un poco más sobre otras posibles moléculas inflamatorias. Porque para el proceso de la enfermedad, también pueden ser interesantes otras cosas.
Así que hicimos una amplia gama de quimiocinas porque la inmunología folicular del cabello es parte de mi interés, y las encontramos presentes, aunque no encontramos cambios importantes entre los diferentes sitios de investigación. Sin embargo, es interesante que si comparas los que detectamos con el artículo de Margo et al, quienes describieron la expresión diferencial de las quimiocinas a lo largo del folículo piloso. Mucho de lo que informaron estaba en el infundíbulo se encontró aquí, excepto que en los pacientes con AGA, no vimos diferencias sustanciales.
Por el contrario, y aquí en esta matriz, me pareció bastante tranquilizador o interesante que en estos marcadores no tuviéramos una gran variabilidad. En la expresión de diferentes proteasas, tuvimos diferencias sustanciales. Y actualmente estamos buscando el significado. Y, obviamente, hay muchas formas de interferencia y para diferentes fuentes de estas proteasas, pero nos pareció muy sorprendente que mientras estábamos en esos niveles de perfil de quimiocinas, realmente tuviéramos que tener cambios significativos. Aquí, teníamos una imagen muy diversa. Lo mencionaré de nuevo cuando lleguemos al ARN.
Entonces, ¿qué hicimos con el ARN? Aquí usamos el desplume. Aquellos que regularmente arrancan los folículos pilosos para el fototricograma saben que es una forma bastante reproducible de recolectar los folículos pilosos. Decidimos mirar los folículos capilares sin etapas. No optamos específicamente por anagen porque sentimos que el proceso AGA realmente se refleja en la mezcla, y que perderíamos cosas si solo optamos por un tipo de folículo piloso.
Así que extrajimos ARN de 13 folículos pilosos, e hicimos microarrays oligoméricos de genoma completo. Encontramos una gran cantidad de datos, por supuesto, siempre obtendrá esta enorme cantidad de datos, pero encontramos más de 700 genes expresados diferencialmente. Y la gran mayoría se expresó tanto en el frontal como en el vértice, lo que está muy en línea también con lo que el Dr. [inaudible], por ejemplo, había publicado sobre las biopsias que tomaron. Y solo una menor proporción de genes se expresó diferencialmente entre frontal y vértice.
Cuando hicimos el análisis de la matriz, en primer lugar, nos complació mucho ver que hicimos la agrupación. Por supuesto, hemos enumerado las áreas de moléculas de interés. Así que nos complació mucho ver que, aunque teníamos los folículos pilosos arrancados y no todas las biopsias, que es una ventaja, por supuesto, muy específica para el material del folículo piloso, encontramos una gran cantidad de genes de diferenciación y ciclo del cabello queratinas, así como proteínas asociadas a la queratina en línea con lo que hemos visto con los datos clínicos, que está en línea con lo que pensamos lo que está sucediendo. Por supuesto, tenemos un crecimiento del cabello menos activo. Así que esto fue reconfortante de una manera que pudimos ver lo que pensamos.
También estábamos interesados en ver muchas moléculas portadoras de solutos de canales iónicos, que se volvieron incluso más interesantes que el estudio del minoxidil, que mencionó Ulrike, donde de hecho encontramos una regulación diferencial también en los tratamientos con minoxidil.
Es interesante saber que tienes más crecimiento del cabello, pero realmente tratar de encontrar nuevas áreas de actividad; esa es realmente la parte desafiante, sentimos, y tomó mucho pensamiento manual y clasificación. de genes. Nos sorprendió encontrar muchos genes asociados con la poliubiquitinación y la metilación. Así que ahora, estamos trabajando gradualmente un poco en estas áreas de interés, y siempre tenemos el problema cuando haces estos microanálisis, especialmente en este de las formas en que hemos obtenido material, que, por supuesto, tú no puede ir al laboratorio y proporcionar estudios de validación exhaustivos sobre el mismo material. Por lo tanto, tratamos de buscar cosas que podamos hacer para fundamentar aún más los hallazgos.
Escogiendo la metilación del ARN. Por ejemplo, hicimos uno: verificamos el estado de metilación del ARN entre los diferentes sitios de investigación y encontramos un frontal / vértice de metilación más alto en comparación con el occipucio. Esa es la N6-metiladenosina, y es interesante por la metilación que se ha asociado con la regulación del reloj circadiano. Y la gente ha demostrado en otros contextos que se puede acortar o extender la regulación del reloj circadiano bloqueando esta metilación de N6. Por lo tanto, podría ser muy interesante cuanto más oímos acerca de tales regulaciones de reloj para analizar más a fondo esas áreas. Esta es ahora la forma en que intentamos trabajar un poco en estas etapas.
La otra cosa es que estábamos tratando de encontrar movimientos coincidentes entre los genes o la expresión de los hallazgos de proteínas. De acuerdo con la idea de que no teníamos diferencias sustanciales en las quimiocinas a nivel de proteínas, encontramos muy pocas moléculas de inflamación puramente típicamente expresadas diferencialmente, lo que no significa que no tuviéramos genes en la inmunidad innata y péptidos antimicrobianos, pero es ahora que tenemos grandes diferencias entre las interleucinas.
Por el contrario, probamos proteasas expresadas significativamente diferencialmente, incluidas serina proteasas, metaloproteinasas y también tipos [inaudibles]. Aunque no todos los equivalentes de ARN saltaron el nivel de significancia, cuando observamos los cambios completos, esto no está en estas diapositivas, encontramos algo similar, como si nunca hubiéramos tenido la situación en la que una proteína era muy alta pero el equivalente de ARN sí lo haría. no coincide en absoluto. Entonces encontramos una tendencia hacia expresiones coincidentes.
Lo que hicimos aquí, por supuesto, es un ensamblaje muy complejo de diferentes piezas de rompecabezas, y esto fue el establecimiento de muchos procedimientos operativos estándar. Pero en general, lo que aprendí durante todo este ejercicio fue que ahora tenemos varias formas de recopilar estas cosas de una manera reproducible. Podemos extraer, cuantificar y cribar. Y muchas de estas cosas, luego las usaremos para la prueba de minoxidil, donde todavía haremos un análisis final, pero funcionó muy bien para monitorear realmente en tiempos cortos: 0, 4 y 8 semanas (Ulrike lo presentó esta mañana ).
Sabemos que estos pacientes, por ejemplo, tienen muda. Pero a pesar de que los fototricogramas solo indicaron esta tendencia. No tuvimos lecturas clínicas significativas durante este tiempo, pero tenemos niveles de ARN muy significativos. Y si pudiéramos configurar un número limitado de moléculas de interés para tener algo así como una lectura en miniatura de ciertos medicamentos que incluye los objetivos de interés, creemos que podríamos aumentar y acelerar enormemente la forma en que observamos la eficacia de los fármacos tópicos. tratos.
Obviamente, siempre hay ventajas y desventajas para los modelos y especialmente el folículo piloso con sus aspectos complejos y diferentes. El folículo piloso no es [inaudible] pero siempre se necesitan todos estos modelos para comprenderlo. Pero lo que creo que ha faltado estos días, y esto se debe en parte a la restricción del material humano, es que no tenemos mucha iniciativa que venga directamente de los pacientes y se haya llevado a los laboratorios.
Muchos de los medicamentos que son actualmente, los medicamentos que usamos principalmente, son efectos secundarios donde otras disciplinas nos informaron sobre efectos secundarios, y luego fuimos al laboratorio e intentamos entender por qué un medicamento que no fue diseñado para ese propósito aumentó el crecimiento del cabello, por ejemplo. Ahora, creo que es el momento de mirar más específicamente en la patología de la enfermedad y luego tratar de buscar estos pequeños nichos nuevos en los que podamos aumentar nuestra comprensión.
Todo este trabajo se realizó en nuestro centro en Charité. La mayoría de ustedes probablemente sepan cuando miran el [inaudible]. Intentamos combinar. Tenemos nuestro ensayo clínico en el laboratorio experimental. Entiendo que gran parte de esta presentación fue muy compleja, realmente tenemos que trabajar con esto paso a paso, pero espero que hayan visto el mismo entusiasmo que tenemos con este tipo de proyectos. Gracias.
