Gérmenes del Folículo Piloso para la Medicina Regenerativa

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La medicina regenerativa del cabello es un enfoque prometedor para la pérdida de cabello, durante el cual las células troncales foliculares autólogas se trasplantan a regiones de pérdida de cabello para regenerar el cabello. Debido a que las células trasplantadas como una suspensión de células individuales apenas generan pelos, se ha explorado la ingeniería de los tejidos tridimensionales (3D) antes del trasplante para mejorar este proceso. Se ha propuesto un enfoque para fabricar agregados celulares enriquecidos con colágeno, llamados perlas capilares (HBs), a través de la constricción espontánea de gotas de colágeno encapsuladas en células. En un estudio las células mesenquimatosas embrionarias de la papila dérmica humana se encapsularon en microgeles de colágeno de 2 μl, que se concentraron >10 veces en volumen durante 3 días de cultivo. Curiosamente, la constricción de HB se atribuyó a las fuerzas de atracción impulsadas por la miosina II e implicó la regulación positiva de los genes foliculares. HBs individuales con células epiteliales sembradas en micropocillos en forma de U formaron estructuras con forma de mancuerna que comprenden agregados respectivos (denominados gérmenes de folículo piloso a base de perlas, bbHFG), durante 3 días de cultivo. Los bbHFG generaron eficientemente los folículos capilares tras el trasplante intracutáneo. Usando un observador automático, este enfoque fue escalable para preparar una gran cantidad de bbHFG, lo cual es importante para aplicaciones clínicas. Por lo tanto, esto podría representar un enfoque robusto y práctico para la preparación de tejidos similares a los gérmenes para la medicina regenerativa capilar.

La pérdida de cabello generalmente ocurre debido a varias causas, como la genética, el envejecimiento, los desequilibrios hormonales, las reacciones autoinmunes y los medicamentos contra el cáncer, y esto está relacionado con la pérdida de células madre responsables de la formación normal del cabello y el ciclo del cabello. Los tratamientos actuales para la pérdida de cabello se basan principalmente en medicamentos y trasplante de cabello autólogo, pero ambos enfoques están asociados con algunas dificultades, como los efectos limitados de los medicamentos y la incapacidad para aumentar el número de cabello en el cuero cabelludo.

La formación del folículo piloso durante el desarrollo embrionario y el ciclo postnatal del cabello se rige por una serie de interacciones entre las células madre foliculares derivadas del epitelio (por ejemplo, las células madre epiteliales foliculares y las células madre epiteliales protuberantes) y las células madre foliculares derivadas del mesénquima (por ejemplo, papila dérmica (DP) células, células dérmicas foliculares). Estudios recientes revelaron que el co-trasplante de estas células madre da como resultado la generación eficiente de folículos capilares y pelos. Las células madre epiteliales foliculares se diferencian y eventualmente forman un tallo piloso. Las células DP proporcionan señales a las células madre epiteliales foliculares, especificando el tamaño, la forma y la pigmentación de los tallos del cabello. Sin embargo, la capacidad de inducción del cabello de ambos tipos de células se pierde gradualmente después del aislamiento de los tejidos in vivo y durante el cultivo de expansión. Por lo tanto, se han examinado varios enfoques para mantener esta capacidad, incluido el uso de factores de crecimiento y moléculas de señalización. Por ejemplo, la pérdida de la capacidad de inducción del cabello de células DP se alivió con el factor de crecimiento de fibroblastos-2 y la proteína morfogenética ósea.

Otro enfoque es fabricar tejidos 3D antes del trasplante. Las células DP forman agregados cuando se cultivan en condiciones de cultivo de gota colgante o adhesivo no celular y exhiben una expresión mejorada de marcadores específicos de DP. Estudios recientes han demostrado que un germen de folículo piloso compartimentado (HFG), que se fabricó integrando dos agregados 3D respectivos de células mesenquimatosas y epiteliales in vitro, podría regenerar eficientemente los folículos capilares. Este es un enfoque sofisticado para reproducir el desarrollo embrionario, pero el desafío asociado con este enfoque es la preparación de una gran cantidad de HFG necesarios para un tratamiento humano (> 3000 HFG / paciente). Esto se debe a que los dos agregados se fusionaron manualmente con una pipeta bajo un microscopio con este enfoque.

Se sembró una mezcla de células epiteliales y mesenquimales en una placa de matriz de micropocillos fabricada en laboratorio y se dejó que formaran agregados en micropocillos. Los dos tipos de células se distribuyeron inicialmente al azar en agregados individuales, pero se separaron espontánea y espacialmente entre sí y formaron un HFG compartimentado. Debido a que las células se auto-organizaron en HFG compartimentadas, este enfoque fue escalable para la preparación simultánea de> 5000 HFG. En el presente estudio, considerando que durante el desarrollo embrionario, un agregado epitelial invagina una capa mesenquimal rica en colágeno y desencadena cambios morfogenéticos posteriores y la generación de folículos capilares, planteamos la hipótesis de que un agregado de células mesenquimatosas rico en colágeno podría ser un componente beneficioso de los HFG. Se prepararon agregados de células mesenquimatosas ricas en colágeno, llamadas perlas capilares (HBs), mediante la contracción de microgeles de colágeno encapsulados en células mesenquimatosas. Luego examinamos si los HBs podrían inducir funciones tricógenas mejoradas in vitro e in vivo en comparación con los HFG preparados con enfoques previos. Además, investigamos si el enfoque HB podría usarse para la preparación en masa de HFG utilizando un micro dispensador automático. Los HFG fabricados también fueron evaluados por su capacidad para generar pelos en la piel de la espalda de ratones desnudos. Esto podría representar un enfoque práctico de preparación de tejidos similar a los gérmenes para la medicina regenerativa capilar.

Se han investigado diversos componentes de la matriz extracelular y sus sustitutos para mejorar la supervivencia, la proliferación y la actividad de inducción capilar de las células DP in vitro. Entre ellos, se demostró que el colágeno es uno de los componentes más eficaces, probablemente porque es la proteína más abundante en los tejidos, incluida la piel. En nuestros experimentos preliminares, las células mesenquimales embrionarias de ratón y las células DP humanas cultivadas en un gel de colágeno mostraron actividad recuperada de ALP, que es una enzima ubicua, pero también un indicador folicular específico de la capa dérmica. Por lo tanto, en este estudio, examinamos un enfoque para preparar injertos de tejido encapsulando células mesenquimales foliculares en microgeles de colágeno.

Los microgeles de colágeno (2 μl / microgel) que contienen células mesenquimales embrionarias de ratón se contrajeron significativamente durante 3 días de cultivo. El diámetro disminuyó de 2,0 mm a 0,5 mm su mínimo cuando la concentración inicial de colágeno fue de 0,6 mg / ml, lo que indica un enriquecimiento de ~ 64 veces en la concentración de colágeno y la densidad celular, dado que los HB son esféricos. Además, la compactación dependía ligeramente del número de células encapsuladas. Aunque esperábamos que la expresión del gen versicano pudiera aumentarse con un número creciente de células encapsuladas en HBs, debido a los efectos de las interacciones célula-célula, este parámetro alcanzó su punto máximo a 10 × 103 células / perla. Esto es más probable debido a la escasez de oxígeno con un mayor número de células, ya que la expresión génica del factor 1α inducido por hipoxia (HIF1α) se reguló por incremento con un mayor número de células. Los resultados son consistentes con nuestro informe anterior de que los niveles de expresión de genes versican y HIF1α dependen positiva y negativamente de la concentración de oxígeno, respectivamente. La dependencia de la concentración inicial de colágeno para la compactación y la expresión del gen versicano también se examinó a la densidad celular fija de 10 × 103 células / perla. Los cambios en el diámetro dependían claramente de la concentración inicial de colágeno. El cambio más significativo se observó a la concentración más baja de 0.6 mg / ml, mientras que la expresión versicana más alta se observó a la concentración más alta de 2.4 mg / ml (Fig. 2E). Extrapolando por el cambio de diámetro, la concentración de colágeno en HBs aumentó de 2.4 mg / ml a ~ 10 mg / ml durante los 3 días de cultivo.

Un tema clave en el campo de la medicina regenerativa capilar es la preparación de microtissues, que deben poseer una alta capacidad tricogénica al momento del trasplante. Además, el enfoque de preparación debe ser escalable a >5000 tejidos. El presente estudio demostró que los HB preparados encapsulando células mesenquimales embrionarias de ratón o células DP humanas en una gota de gel de colágeno podrían proporcionar un microambiente preferible para estas células. En comparación con el cultivo esferoide convencional, la expresión de versican y ALP se reguló en HBs y el trasplante de HBs en ratones desnudos resultó en un aumento de casi el doble en el número de hebras de cabello generadas. El enfoque de HB se combinó además con esferoides formados a partir de células epiteliales, lo que dio como resultado construcciones similares a HFG (bbHFG) que generaron pelos de manera más eficiente que los enfoques anteriores. Debido a que los bbHFG se formaron espontáneamente a través de la adhesión célula-célula y las fuerzas de atracción celular en geles de colágeno, esta preparación se considera escalable utilizando un microdispensador automático. Aunque son necesarios más estudios con células derivadas de individuos con pérdida de cabello, esta tecnología podría presentar una nueva vía para la fabricación de microtejidos para la terapia regenerativa del cabello.

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