El extracto en alcohol de la semilla de Vernonia anthelmintica willd (L.) contrarresta la inhibición del crecimiento del folículo piloso murino inducida por el estrés
Como una de las enfermedades de la piel más comunes, la caída del cabello tiene un impacto social negativo en los pacientes al reducir su calidad de vida, aunque no es potencialmente mortal. La experiencia clínica ha sugerido durante mucho tiempo que el estrés psicológico juega un papel importante en el desencadenamiento y exacerbación de los trastornos del crecimiento del cabello. Como se informó en las referencias, la alopecia areata (AA), el efluvio telógeno, el liquen planopilaris (LPP) pueden tener relaciones con eventos estresantes.
La Vernonia anthelmintica (L.) willd es una hierba urgur tradicional en China desde hace mucho tiempo. Crece también en regiones de India y Pakistán. Se ha demostrado que su extracto en alcohol (AVE) promueve el crecimiento del folículo piloso en ratones. Un estudio se hizo para investigar los efectos del AVE en el crecimiento del cabello en ratones estresados y su posible mecanismo de acción.
Los efectos del AVE en el crecimiento del folículo piloso se examinaron mediante un estudio in vivo e in vitro.
Las muestras botánicas fueron autenticadas por el profesor Tiemin Ai (Facultad de Farmacia, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín). Su muestra se ha depositado en el herbario de la Facultad de Medicina Tradicional China de la Universidad Farmacéutica de China (voucher núm. 2011-1105).
Se preparó el extracto mediante extracción por solvente con etanol al 60% de acuerdo con el estudio anterior. El polvo de color marrón oscuro de AVE se obtuvo después de ser desengrasado y secado, los componentes han sido identificados en el perfil de HPLC.
Animales
Como el órgano más grande del cuerpo humano, la piel protege al ser humano de factores estresantes exógenos. El folículo piloso es un apéndice importante de la piel, que muestra un ciclo capilar con tres períodos de crecimiento activo (anágeno), degenerativo (catágeno) y de reposo relativo (telógeno). En todas las especies de mamíferos, la melanogénesis folicular está acoplada a anágena, cesa durante la catágena, ausente durante la telógena. Aparte de los humanos, los melanocitos de los ratones C57BL/6 solo se localizan en la región del bulbo piloso, el color de la piel dorsal parece ser rosado en el telógeno y cambia a negro en la etapa anágena. Por lo tanto, los folículos pilosos de ratones C57BL/6 parecen ideales para estudiar los folículos pilosos y detectar agentes promotores del crecimiento del cabello.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 machos singénicos (5-6 semanas de edad, con un peso de 18-22 g) del Centro de Medicina Comparativa de la Universidad de Yangzhou (China). Todos los ratones se dejaron tranquilos y se aclimataron durante 7 días antes del inicio de los estudios en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad del Sureste (China). Las condiciones estándar de las instalaciones para animales se mantuvieron de la siguiente manera: temperatura 21-24 ° C; Ciclo de luz / oscuridad de 12 h (luces encendidas de 06:00 a 18:00); humedad 50–60%. Durante este período se proporcionaron alimentos y agua esterilizada al libitum. Todos los procedimientos experimentales y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité de Estudio de Animales de la Universidad Farmacéutica de China (número de permiso: PMY33069N).
Sincronización del ciclo del cabello
El día 8 del experimento, anestesiamos a todos los ratones y aplicamos una mezcla de cera y colofonia (1: 1 en peso) a la piel de la espalda murina (desde el cuello hasta la cola) para inducir el anágeno. Luego, retiramos la mezcla y retiramos todos los tallos del cabello para inducir la sincronización del ciclo del cabello. Los ratones no estuvieron expuestos a estrés por inmovilización el día de la depilación.
Intervención farmacéutica
Se asignaron aleatoriamente cuarenta ratones C57BL/6 a cuatro subgrupos (n = 10 en cada grupo): (1) el grupo no estresado o de control (CTRL); (2) grupo de estrés de restricción crónico (RS): aplicación de estrés de restricción crónico sin fármaco; (3) AVE + estrés de contención crónico (AR): aplicación de AVE (disuelto en 0,5% CMC-Na) con 80 mg / kg / día por sonda durante 23 días, también aplicado con estrés de contención crónico; (4) 5% de minoxidil + estrés de contención crónico (MR): se aplicaron tópicamente 100 μl de minoxidil al 5% (Mandi, China) diariamente sobre la piel de la espalda murina durante 16 días después de la depilación, también aplicado con estrés de contención crónico. Los grupos CTRL, RS y MR recibieron el mismo volumen de vehículo (0,5% CMC-Na) durante 23 días en paralelo con el grupo AR.
Expusimos ratones macho C57BL/6 a estrés de restricción crónica para inducir la inhibición del crecimiento del folículo piloso murino. Los efectos de AVE se examinaron mediante análisis histológico, inmunofluorescencia para Ki67 y inmunorreactividad de citoqueratina 19, ensayo de transferencia Western en expresiones de tirosinasa y proteínas relacionadas e inmunofluorescencia para fibras nerviosas. En el cultivo de órganos de folículos de vibrisas de ratón, utilizamos la sustancia P como factor inductor de catágenos del crecimiento del folículo piloso, y medimos el alargamiento de los tallos del cabello y la expresión de la proteína receptora de neuroquinina-1 mediante la aplicación de AVE.
Recolección de tejidos
Todos los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical bajo anestesia el día 26 del experimento (día 18 después de la depilación). Se recolectaron muestras de piel dorsal de aproximadamente 2 x 5 cm y luego se fijaron parcialmente en paraformaldehído al 4% para realizar la tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Las muestras de piel restantes se criopreservaron inmediatamente en nitrógeno líquido para realizar análisis de inmunofluorescencia y transferencia de Western.
Examen histológico
Se obtuvieron muestras de piel como se describió anteriormente. Los tejidos se incrustaron en parafina y se cortaron secciones de 4 µm de grosor para la tinción con hematoxilina y eosina. Luego, analizamos las secciones con un aumento de 100 × y 400 × mediante el microscopio de fluorescencia Olympus BX41. En áreas representativas con un aumento de 100x, se midieron los parámetros del cabello, incluido el grosor de la dermis y la distancia entre el germen del cabello y la capa subcutánea (n = 10 / ratón). Se cuantificó el número total de folículos pilosos al menos 10 campos visuales por ratón, de 3 a 5 ratones en cada grupo.
Evaluación del ciclo del cabello
El estadio del cabello se evaluó macroscópicamente de acuerdo con su morfología de la papila dérmica y las glándulas sebáceas como se describió anteriormente (anágeno: anágeno I = factor 1, anágeno II = factor 2, anágeno III = factor 3, etc . para catágeno: catágeno I = factor 1, catágeno II = factor 2, catágeno III = factor 3, etc.). El número de folículos pilosos en cada etapa específica se multiplica por el factor correspondiente. Los resultados de cada suma se sumaron y dividieron por el número total de folículos pilosos contados.
Inmunofluorescencia
Para la histoquímica de inmunofluorescencia, se incubaron criosecciones en serie (12 μm de espesor) con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Luego, observamos productos de reacción por anticuerpos secundarios marcados con TRITC (Cwbio, Beijing, China) [26]. Las criosecciones se contratiñeron con DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la identificación de núcleos celulares. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios y concentraciones: anticuerpo Ki67 a 1: 400 (Abcam), citoqueratina19 a 1: 200 (Abcam), anticuerpo SP a 1: 10000 (Abcam), anticuerpo CGRP a 1: 400 (Abcam). Se usó PBS para reemplazar el anticuerpo primario en controles negativos. Nunca se contaron las fibras mediante patrones de estructuras con tinción lineal fuerte y continua a 200 × y 400 × aumentos mediante el microscopio de fluorescencia Olympus BX41. Se contó el número de fibras nerviosas marcadas en el compartimento dérmico. Se estudiaron al menos 10 campos visuales por ratón, de 3 a 5 ratones en cada grupo.
Análisis de Western Blot
Se separaron muestras de proteína murina (30 μg) lisadas en tampón de lisis frío (fenilmetilsulfóxido 1 mM, aprotinina al 0,01%, Triton X-100 al 1% y solución salina tamponada con fosfato 0,1 M, pH 6,8) mediante gel SDS-PAGE al 10%, y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Millipore). Luego, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% (que contenía Tween-20 al 0,05%) durante 1 ha temperatura ambiente y se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios apropiados durante la noche (4ºC). Después de lavar tres veces con TBST (5 a 10 min cada vez), las membranas se incubaron en anticuerpos secundarios durante 1 h (temperatura ambiente). Se utilizó un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorado para visualizar las bandas inmunorreactivas. Se utilizó la cantidad uno (Bio-Rad) para cuantificar la expresión de la proteína de tres experimentos independientes. Los siguientes anticuerpos primarios se utilizaron en el análisis de transferencia Western: NK-1R (1: 800, Santa Cruz), TYR (1: 300, Santa Cruz), TRP-1 (1: 300, Abcam), TRP-2 (1: 800, Abcam), MITF (1: 800, Santa Cruz) y β-actina (1: 1000, Sigma).
Aislamiento y cultivo de folículos de vibrissa de ratón y estudio in vitro
Se obtuvieron folículos de vibrisas de ratón de ratones C57BL/6 machos de 5 semanas de edad. Se utilizaron cuchillos y pinzas para cosechar los folículos pilosos de vibrisas normales de la región del labio superior. Los folículos de vibrissa aislados se colocaron durante 20 min en estreptomicina de D-Hank. Después de lavar dos veces con PBS, los folículos se colocaron inmediatamente en microplacas de 24 pocillos que contenían el medio de cultivo y se cultivaron en CO2 al 5% durante 8 días a 37 ° C de acuerdo con el método informado.
Los folículos de vibrissae aislados se dividieron en 3 grupos: (1) grupo de control: solo medio de cultivo; (2) Grupo SP: 10−8 mol / L de sustancia P + medio de cultivo; (3) Grupo AVE: 10 μg / ml AVE + 10−8 mol / L sustancia P + medio de cultivo. Cada grupo usó de 10 a 15 folículos. La concentración de AVE y SP se eligió basándose en estudios previos [22, 31]. La longitud del tallo del cabello que crecía se midió diariamente durante 8 días mediante el análisis de imágenes digitales. Además, se utilizó Western Blot para detectar la expresión de proteínas de NK-1R.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± S.E.M. La significación estadística se realizó utilizando la prueba t de Student de dos colas no apareada o ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey, aceptando la significación ap <0,05. Utilizamos GraphPad Prism (Reino Unido) para el análisis estadístico.
Los resultados mostraron que el AVE contrarresta la inhibición del crecimiento del folículo piloso murino causada por el estrés de restricción crónica al inducir la conversión de telógeno en anágeno e inhibiendo la fase catágena prematura, aumentando los queratinocitos del bulbo y la proliferación de células madre protuberantes, promoviendo la melanogénesis y reduciendo la cantidad de sustancia P y el gen de calcitonina -Fibras nerviosas peptídicas relacionadas. Además, AVE también contrarrestó la inhibición del crecimiento del folículo piloso murino causada por la sustancia P en el cultivo de órganos.
El estrés puede actuar como un factor precipitante en la aparición o exacerbación de la caída del cabello a través de un mecanismo psicosomático. Investigaciones anteriores han identificado que el estrés psicológico puede alterar el ciclo del cabello y afectar el crecimiento del cabello aumentando las células apoptóticas, inhibiendo las células madre del bulbo piloso y la proliferación de los queratinocitos del bulbo piloso, promoviendo la desgranulación de los mastocitos, induciendo catágenos prematuros e inflamación neurogénica. Las fibras nerviosas sensoriales y autónomas están ricamente inervadas con folículos pilosos. Existe una interacción íntima entre la inervación cutánea y la progresión del ciclo del folículo piloso. Numerosas evidencias han demostrado que el crecimiento del cabello está profundamente influenciado y regulado por neuropéptidos que participan en las respuestas sistémicas al estrés. Se ha confirmado que la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) manipulan eficazmente las funciones de la piel y las células inmunitarias, incluida la proliferación celular, la presentación de antígenos y la producción de citocinas en condiciones normales y patológicas en el modelo de ratones C57B/6. Además, en ausencia de una inervación perifolicular funcional, ambos neuropéptidos tienen efectos inhibidores similares sobre el crecimiento del folículo piloso cultivado en órganos. Arck y col. encontraron que el porcentaje de neuronas sensoriales SP y CGRP puede regularse positivamente bajo exposición al estrés en la piel dorsal murina. Los cambios neurobiológicos, neurorendocrinos y neuroinmunológicos asociados con el estrés psicoemocional brindan una nueva perspectiva y opción terapéutica para estudiar los problemas de crecimiento del cabello.
En conclusión el AVE puede ser un nuevo candidato eficaz para el tratamiento de la pérdida de cabello inducida por estrés.
